נייַעס

יפּטג (יסאָפּראָפּיל-β-ד-טהיאָגאַלאַקטאָסידע) איז אַן אַנאַלאָג פון β-גאַלאַקטאָסידאַסע סאַבסטרייט, וואָס איז העכסט ינדוסאַבאַל.אונטער די ינדאַקשאַן פון IPTG, די ינדוסער קענען פאָרעם אַ קאָמפּלעקס מיט די רעפּרעססאָר פּראָטעין, אַזוי אַז די קאַנפאָרמיישאַן פון די רעפּרעססאָר פּראָטעין איז פארענדערט, אַזוי אַז עס קענען ניט זיין קאַמביינד מיט די ציל דזשין, און די ציל דזשין איז יפישאַנטלי אויסגעדריקט.אַזוי ווי זאָל די קאַנסאַנטריישאַן פון IPTG זיין באשלאסן בעשאַס דער עקספּערימענט?איז די גרעסערע די בעסער?
ערשטער, לאָמיר פֿאַרשטיין דעם פּרינציפּ פון IPTG ינדאַקשאַן: E. קאָלי ס לאַקטאָוס אָפּעראָן (עלעמענט) כּולל דריי סטראַקטשעראַל גענעס, ז, י און א, וואָס ריספּעקטיוולי ענקאָוד β-גאַלאַקטאָסידאַסע, פּערמעאַסע און אַסעטילטראַנספעראַסע.lacZ כיידראָליסיז לאַקטאָוס אין גלוקאָוס און גאַלאַקטאָוס, אָדער אין אַללאָ-לאַקטאָוס;lacY אַלאַוז לאַקטאָוס אין די סוויווע צו פאָרן דורך די צעל מעמבראַנע און גייט אריין די צעל;lacA טראַנספערס די אַסעטיל גרופּע פון ​​אַסעטיל-קאָאַ צו β-גאַלאַקטאָסידע, וואָס ינוואַלווז רימוווינג טאַקסיק ווירקונג.אין דערצו, עס איז אַן אַפּערייטינג סיקוואַנס אָ, אַ סטאַרטינג סיקוואַנס P און אַ רעגולאַטאָרי דזשין I. די I דזשין קאָד איז אַ רעפּרעססאָר פּראָטעין וואָס קענען בינדן צו די שטעלע אָ פון דער אָפּעראַטאָר סיקוואַנס, אַזוי אַז די אָפּעראָן (מעטאַ) איז ריפּרעסט און אויסגעלאשן.עס איז אויך אַ ביינדינג פּלאַץ פֿאַר קאַטאַבאָליק דזשין אַקטיוואַטאָר פּראָטעין-קאַפּ ביינדינג פּלאַץ אַפּסטרים פון די ינישיייטינג סיקוואַנס פּ. די פּ סיקוואַנס, אָ סיקוואַנס און קאַפּ ביינדינג פּלאַץ צוזאַמען קאַנסטאַטוט די רעגולאַטאָרי געגנט פון די לאַק אָפּעראָן.די קאָדירונג גענעס פון די דריי ענזימעס זענען רעגיאַלייטאַד דורך דער זעלביקער רעגולאַטאָרי געגנט צו דערגרייכן די קאָואָרדאַנייטיד אויסדרוק פון דזשין פּראָדוקטן.

אין דער אַוועק פון לאַקטאָוס, די לאַק אָפּעראָן (מעטאַ) איז אין אַ שטאַט פון פאַרשטיקונג.אין דעם צייַט, די לאַק רעפּרעססאָר אויסגעדריקט דורך די איך סיקוואַנס אונטער די קאָנטראָל פון די פּי פּראָמאָטער סיקוואַנס ביינדז צו די אָ סיקוואַנס, וואָס פּריווענץ רנאַ פּאָלימעראַסע פון ​​ביינדינג צו די פּ סיקוואַנס און ינכיבאַץ טראַנסקריפּציע האַסכאָלע;ווען לאַקטאָוס איז פאָרשטעלן, די לאַק אָפּעראָן (מעטאַ) קענען זיין ינדוסט אין דעם אָפּעראָן (מעטאַ) סיסטעם, די פאַקטיש ינדוסער איז נישט לאַקטאָוס זיך.לאַקטאָוס גייט אריין די צעל און איז קאַטאַלייזד דורך β-גאַלאַקטאָסידאַסע צו ווערן קאָנווערטעד צו אַללאַקטאָוס.דער יענער, ווי אַ ינדוסער מאַלאַקיול, ביינדז צו די רעפּרעסאָר פּראָטעין און ענדערונגען די פּראָטעין קאַנפאָרמיישאַן, וואָס פירט צו די דיססאָסיאַטיאָן פון די רעפּרעססאָר פּראָטעין פון די אָ סיקוואַנס און טראַנסקריפּציע.יסאָפּראָפּילטהיאָגאַלאַקטאָסידע (IPTG) האט די זעלבע ווירקונג ווי אַללאַקטאָוס.עס איז אַ זייער שטאַרק ינדוסער, וואָס איז נישט מעטאַבאָליזעד דורך באַקטיריאַ און איז זייער סטאַביל, אַזוי עס איז וויידלי געניצט אין לאַבאָראַטאָריעס.

ווי צו באַשליסן די אָפּטימאַל קאַנסאַנטריישאַן פון IPTG?נעמען E. קאָלי ווי אַ בייַשפּיל.
די E. coli BL21 דזשאַנעטיקלי ענדזשאַנירד שפּאַנונג מיט די positive רעקאָמבינאַנט פּגעקס (קגרפּ / מסקט) איז ינאַקיאַלייטיד אין לב פליסיק מיטל מיט 50μג · מל-1 אַמפּ, און קאַלטשערד יבערנאַכטיק ביי 37 ° C.די אויבן קולטור איז געווען ינאַקיאַלייטיד אין 10 לאגלען פון 50 מל פריש לב פליסיק מיטל מיט 50μg · מל-1 אַמפּ אין אַ פאַרהעלטעניש פון 1:100 פֿאַר יקספּאַנשאַן קולטור, און ווען די OD600 ווערט איז 0.6 ~ 0.8, IPTG איז צוגעגעבן צו די לעצט קאַנסאַנטריישאַן.עס איז 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 ממאָל·ל-1.נאָך ינדאַקשאַן אין דער זעלביקער טעמפּעראַטור און דער זעלביקער צייט, 1 מל פון די באַקטיריאַל לייזונג איז גענומען פון עס, און די באַקטיריאַל סעלז זענען געזאמלט דורך סענטריפוגיישאַן און אונטערטעניק צו SDS-PAGE צו אַנאַלייז די השפּעה פון פאַרשידענע IPTG קאַנסאַנטריישאַנז אויף פּראָטעין אויסדרוק, און דערנאָך. אויסקלייַבן די IPTG קאַנסאַנטריישאַן מיט די גרעסטן פּראָטעין אויסדרוק.
נאָך יקספּעראַמאַנץ, עס וועט זיין געפונען אַז די קאַנסאַנטריישאַן פון IPTG איז נישט ווי גרויס ווי מעגלעך.דאָס איז ווייַל IPTG האט אַ זיכער טאַקסיסאַטי צו באַקטיריאַ.יקסיד די קאַנסאַנטריישאַן וועט אויך טייטן די צעל;און בכלל גערעדט, מיר האָפן אַז די מער סאַליאַבאַל פּראָטעין אויסגעדריקט אין דער צעל, די בעסער, אָבער אין פילע קאַסעס ווען די קאַנסאַנטריישאַן פון IPTG איז צו הויך, אַ גרויס סומע פון ​​ינקלוזשאַן וועט זיין געשאפן.גוף, אָבער די סומע פון ​​סאַליאַבאַל פּראָטעין דיקריסט.דעריבער, די מערסט פּאַסיק יפּטג קאַנסאַנטריישאַן איז אָפט נישט די ביגער די בעסער, אָבער די נידעריקער די קאַנסאַנטריישאַן.
דער ציל פון ינדאַקשאַן און קאַלטיוויישאַן פון דזשאַנעטיקלי ענדזשאַנירד סטריינז איז צו פאַרגרעסערן די טראָגן פון די ציל פּראָטעין און רעדוצירן קאָס.דער אויסדרוק פון די ציל דזשין איז ניט בלויז אַפעקטאַד דורך די שפּאַנונג ס אייגן סיבות און די אויסדרוק פּלאַזמיד, אָבער אויך דורך אנדערע פונדרויסנדיק טנאָים, אַזאַ ווי די קאַנסאַנטריישאַן פון די ינדוסער, די ינדאַקשאַן טעמפּעראַטור און די ינדאַקשאַן צייט.דעריבער, אין אַלגעמיין, איידער אַן אומבאַקאַנט פּראָטעין איז אויסגעדריקט און פּיוראַפייד, עס איז בעסטער צו לערנען די ינדאַקשאַן צייט, טעמפּעראַטור און IPTG קאַנסאַנטריישאַן אין סדר צו אויסקלייַבן די צונעמען טנאָים און באַקומען די בעסטער יקספּערמענאַל רעזולטאַטן.